جهت اخذ مشاوره تخصصی رایگان و خرید محصول نانونقره پادنار اینجا کلیک کنید .

بررسي نانو نقره دبکوپاک و اثرات ضد باكتري آن

چكيده
زمينه و هدف:
نانوذرات نقره به دليل خاصيت ضدعفوني كنندگي كاربردهاي وسيعي در زمينه ي پزشكي و درمان عفونت هاي باكتريايي دارند.

سنتزشيميايي، بيوسنتز و خواص آنتي باكتريال نانوذرات نقره قبلاً مورد مطالعه قرار گرفته، اما با توجه به هزينه ي بالاي سنتز شيميايي آنها و افزايش مقاومت باكتريها به آنتي بيوتيكها، بررسي بيوسنتز نانوذرات نقره و نيز تاثير آنها بر سويه هاي باليني و استاندارد باكتريهاي مختلف داراي اهميت بسزايي ميباشد.

روش كار:
نانوذرات نقره به دو روش احياء شيميايي و بيوسنتز با استفاده از سوپرناتانت باكتريال سنتز شدند و اندازه و توزيع اندازهي ذرات با ميكروسكوپ الكتروني عبوري مورد بررسي قرار گرفت. سپس نانوذرات سنتز شده به روش احياء شيميايي به منظور بررسي اثر ضد باكتريايي، به محيط كشت TSB حاوي سويههاي مختلف باكتريها درون لولهي آزمايش اضافه شدند و كمترين غلظت مهاركنندگي آنها محاسبه شد.

يافته ها: نانوذرات سنتز شده به روش احياء شيميايي مونوديسپرسيتي بالايي داشتند، در حالي كه روش بيوسنتز، نانوذراتي با پليديسپرسيتي بالا سـنتز نمـود.
نانونقره ي كوچكتر حاصل از احياء شيميايي، فعاليت خوبي بر ضد باكتريهاي گرم منفي و گرم مثبـت داشـت و در غلظـت 2/0 ميلـيمـولار از رشـد تمـام باكتريها جلوگيري كرد، اما نانوذرات درشت تر فعاليت بسيار كمتري داشتند.

نتيجه گيري: روش بيوسنتز با استفاده از باكتريها روشي كم هزينه است، اما نانوذرات پليديسپرس ايجاد ميكند. نانوذرات نقره با توجـه بـه فعاليـت خـوب آنتي باكتريالی، ميتوانند جايگزين مناسبي براي آنتي بيوتيكها باشند، اما بايد توجه شود كه ميزان مقاومت سويه هاي باليني در مقايسه با سويه هـاي اسـتاندارد بالاتر ميباشد و بايد پيش از تجويز نانوذرات، مقاومت باكتريها نسبت به آنها مورد بررسي قرار گيرد.

مقدمه

نانوذرات فلزي در زمينـه هـاي مختلـف علمـي وصنعتي مورد استفاده قـرار مـيگيرنـد و درايــن ميــان، نــانوذرات نقــره (AgNPs (بــه دليــل رســانايي خــوب، پايــداري شــيميايي، خــواص
كاتاليتيك، فتونيك و اپتوالكترونيـك بسـيار مـورد توجه بوده اند(در زمينه ي تحقيقات مـرتبط بـاعلــوم زيســت شناســي، AgNPs بــه عنــوان مــواد باكتري كش استفاده شده اند، البته اخيراً در رديابي DNA نيز كاربرد پيـدا كـرده انـد.
نقـره از ديرباز به عنوان يك ماده ي ضدعفوني كننده مـورد توجه بوده است، اما به دليل خاصيت باكتري كشي كم و با توسعه ي آنتي بيوتيكهـا و مـواد شـيميايي ضد باكتري، استفاده از آن محدود شده بود. با اين حال، با توسعه ي توليد AgNPs اسـتفاده ي مجـدد از نقره به عنوان ماده ي باكتري كش قدرتمند رونق يافته است

بــراي ســنتز نــانوذرات، روشهــاي شــيميايي متفـــاوتي عرضـــه شـــده انـــد:
1. از جملـــه روش ميكروامولسيون
2. سنتز با كمك امواج ريز مـوج
(ميكـــرو ويـــو)
3. روش اســـتفاده از الگـــو(Template)
4. (روشهاي احياء شيميايي
5.احياء الكتروشيميايي
6. (احياء با روش پرتوتابي
7. احياء شيميايي در محلول آبي
8. احیاءشيميايي بدون محلول آبي
9. احياء القاء شـده با نور يا احياء فتوكاتاليتيك
10.احياء بـا كمـك امواج اولتراسونيك و روشهـاي بيوشـيميايي

از معايب مشـخص روشهـاي احيـاء شـيميايي، استفاده از عوامل احياء كننده است كه از يك سـو ميتوانند بـراي سـلامتي انسـان و محـيط زيسـت خطرات بالقوه داشته باشند و از سوي ديگر معمولاً
گرانقيمـت هسـتند. در نتيجـه اخيـراً روشهـاي بيولوژيــك ســنتز نــانوذرات توســعه يافتــهانــد تــا نانوذراتي سازگار بـا محـيط زيسـت و ارزانقيمـت توليد كنند.
بيوسنتز نانوذرات توسـط ميكـروبهـا اخيـراً بـه عنوان يك جـايگزين مناسـب جهـت توليـد انبـوه نــانوذرات مــورد توجــه قــرار گرفتــه اســت .

“نانومواد سبز” نامي است كه بـراي ايـن دسـته از نـانوذرات اسـتفاده مـيشـود و هـدف بسـياري از تحقيقات در نانوفنـاوري مـيباشـند.
جالـب توجـه
است كه در زمينهي توسعه ي پروتكل هاي تجربـي توليد سريع و قابل اعتماد نانومواد سبز، فاكتورهاي متعددي مانند تركيـب شـيميايي نـانومواد نهـايي، اندازه ي ذرات آنها، مونوديسپرسيتي بالا و قابليـت توليد مقادير زياد مورد تاكيد هستند. بيوسنتز AgNPs توسط باكتريها و قارچها قبلاً مورد مطالعه قرار گرفته اسـت. بـه طـور مثـال، در ايران سجادي و همكاران از مايع رويي كشت قـارچ فوزاريوم اگزيسپوريوم جهت توليد نانوذرات نقره در مقياس آزمايشگاهي استفاده نمودند

و همكـاران در هندوسـتان از مـايع رويـي كشــت آسپرژيلوس نـايجر جهـت بيوسـنتز AgNPs بهـره جســــتند (20 .(Sadhasivam و همكــــاران در جمهوري كـره بيوسـنتز AgNPs را بـا اسـتفاده از استرپتومايســس هايگروســكوپيكوس بــه انجــام رساندند

يكي از معايب استفاده از قارچها در بيوســنتز AgNPs مــدت زمــان طــولاني رشــد سلولهاي قارچي است. موكرجي و همكـاران (22 ( نشان دادند كـه بيوسـنتز نـانوذرات فلـزي توسـط قارچها حدود 120 ساعت طول ميكشد، در حـالي كه كـلاوس و همكـاران ايـن زمـان را بـراي باكتريهـا در حـدود 24 سـاعت گـزارش نمودنـد.

اخيـراً كـلاوس و همكـاران توليـد نـانوذرات نقره ي شش ضلعي و نيز كروي را توسـط بـاكتري سودوموناس استوتزري AG259 ثابت كردهانـد. در ايــن مطالعــه عــلاوه بــر اســتفاده از روش احيــاء شيميايي جهت سنتز نانونقره، از سوپرناتانت شـش باكتري استاندارد نيز جهت توليد آن ها اسـتفاده و نتايج سنتز و خواص آنتيميكروبـي آنهـا مقايسـه شده است.

روش كار
سنتز نانوذرات كوچـكتـر نقـره بـا روش احيـاء شيميايي:
30 ميلـي ليتـر آب مقطـر اسـتريل درون ارلن استريل كه داخل بشر حاوي يـخ بـود ريختـه شد.

67 ميكروليتر از محلول سديم بوروهيدرات 2 ميلـي مـولار بـه آن اضـافه گرديـد و 1 ميلـيليتـر محلول AgNO3 2 ميلي مـولار بـه صـورت قطـره قطره اضافه شد تا محلول زرد رنگ به دسـت آيـد. ارلن از روي يخ برداشـته شـد و محتويـات آن بـه صورت قطره قطره به ارلـن حـاوي 20 ميلـيليتـر محلول تري سديم سيترات 2 ميلي مـولار كـه روي شيكر بـا دور 150RPM قـرار گرفتـه بـود، اضـافه گرديد. محلول نهـايي درون ميكروتيـوب هـاي 5/1 ميلــي ليتــر تقســيم و بــه مــدت 15 دقيقــه در 14000G ســـانتريفيوژ گرديـــد.

جهـــت حـــذف آلودگيها و مواد اضافي واكنش، سه بار شستشـوي رسوب نانوذرات بـا اسـتفاده از آب مقطـر اسـتريل انجام گرفت. رسـوب نهـايي در 10 ميلـيليتـر آب مقطر استريل ديسپرس گرديد. غلظت نقره ي احياء شده ي فلزي در اين محلول معادل 2/0 ميلي مولار بود .

سنتز نـانوذرات درشـت تـر نقـره بـا روش احيـاء شيميايي:
30 ميلـي ليتـر آب مقطـر اسـتريل درون ارلن استريل كه داخل بشر حاوي يـخ بـود ريختـه شد. 67 ميكروليتر از محلول سديم بوروهيدرات 2 ميلي مولار بـه آن اضـافه گرديـد و 16 ميلـي ليتـر محلول نيترات نقره 2 ميليمولار به صـورت قطـره قطره اضافه شد تا محلول قهوهاي رنـگ بـه دسـت آيد. بقيه ي مراحل همانند مرحلهي قبل بـه انجـام رسيد. غلظت نقرهي احيـاء شـده ي فلـزي در ايـن محلول معادل 2/3 ميلي مولار بود

سنتز نانوذرات نقره با روش احياء شيميايي و روش بيوسنتز :
مجله علوم پزشكي رازيدوره 19 ،شماره 103 ،دي 1391 67 سنتز نانوپارتيكل نقـره بـه روش مخلـوط كـردن اجزاء واكنش بهطور همزمان و بررسي تاثير آن بـر اندازهي ذرات: نمونهاي ديگر از نانوپارتيكل نقره به روش مخلوط كردن همزمان اجـزاء واكـنش تهيـه شـد. در ايـن روش 30 ميلـي ليتـر آب مقطـر، 67 ميكروليتر سديم بوروهيدرات، 1 ميليليتر محلـول نيترات نقره 2 ميلـيمـولار و 20 ميلـيليتـر تـري سديم سيترات بهطور همزمان با هم مخلوط شدند كه محلولي زرد رنگ ايجاد شد. در واكنشـي ديگـر 30 ميلــي ليتــر آب مقطــر، ميكروليتــر ســديم بوروهيدرات، 16 ميليليتر محلول نيتـرات نقـره 2 ميليمولار و 20 ميليليتر تري سديم سـيترات بـه طور همزمان بـا هـم مخلـوط شـدند كـه محلـول قهوه اي رنگي به دست آمد. بررسي تاثير حجم توليد بر اندازهي نـانوذرات بـا افزايش حجم توليـد بـه ميـزان پـنج برابـر: حجـم تمـامي محلـولهـايي كـه جهـت سـنتز نـانونقره (محلول زرد رنگ) به كار رفتند پنج برابر گرديد تا تاثير حجم توليـد بـر انـدازهي نـانوذرات مشـخص گردد. در روش انجام كار تغييـر تكنيكـي ديگـري داده نشد.

سنتز نانوپارتيكل نقره با اسـتفاده از سـوپرناتانت باكتريــايي:
از شــش بــاكتري اســتاندارد شــامل
– اشريشــيا كلــي ســويهي DH5α ،
– اشريشــيا كلــيســويهي K12 ،
– اشريشــيا كلــي ATCC35218،
– باسيلوس سرئوس ATCC9634 ،
– اسـتافيلوكوكوس اورئـوس ATCC25923
– انتروكوكـوس فكـاليس ATCC29212

در 30 ميلـيليتـر محـيط كشـت مايع TSB به صـورت جداگانـه كشـت 18 سـاعت تهيه شد. محيط كشت مايع درون لولههاي فالكون تقســـيم شـــد و بـــه مـــدت 15 دقيقـــه در دور 13000RPM سانتريفيوژ شد. مايع رويي بـا دقـت برداشــته و پــس از فيلتراســيون بــا فيلتــر 25/0 ميكرون، در ارلن اسـتريل ريختـه شـد.

بـه مـايع رويي درون ارلن كه بر روي يـخ قـرار گرفتـه بـود، محلول نيترات نقره 2 ميليمولار قطره قطره اضافه شد تـا محلـول زرد رنـگ بـه دسـت آيـد. بقيـهي مراحل مانند روش سنتز شيميايي انجام گرفت. آزمون پراكنش اشعه ي X) XRD :(براي بررسـي دقيق يونها و مولكولهاي به كار رفته در سـاختار محصول نهايي ناشي از سـنتز شـيميايي نـانوذرات نقره و نيز براي بررسي فازهاي كريستالي آن ها، از روش پراكنش اشعه X استفاده شد.

اين آزمـون در زاويه ي تابش معادل 2θ و در دامنه ي 10-0 درجه و بــا اســتفاده از دســتگاه ray-X Macscience Diffractometer مجهـز بـه منبـع فتـون Kα Cu .شـد انجـام) 40 kV, 20 mA, λ = 0.154 nm) الگوي XRD به دست آمده با داده هـاي اسـتاندارد مركــز بــين المللــي داده هــاي پــراكنش (ICDD) مقايسه و تفسير شد.

بررســـي شـــكل، انـــدازه و نحـــوه ي توزيـــع (ديسپرسيون) نانوذرات با استفاده از ميكروسـكوپ الكترونـي عبـوري:
محلـولهـاي نـانوذراتي كـه در مراحل متفـاوت و بـا روشهـاي گونـاگون (احيـاء شيميايي يا استفاده از سوپرناتانت باكتريال) سـنتز شده بودند، بـا اسـتفاده از ميكروسـكوپ الكترونـي (Transmission Electron Microscope) عبوري مورد بررسي قرار گرفتند.

بدين صورت كه محلـول نانوذرات بـه مـدت 20 دقيقـه تحـت تـاثير امـواج اولتراسونيك با فركانس 50 هرتـز قـرار گرفـت تـا ديسپرســيون مناســب نــانوذرات ايجــاد شــود و از اگريگاسـيون آنهـا جلـوگيري بـه عمـل آيـد. 15 ميكروليتر از محلول مورد نظر با استفاده از سـمپلر و نوك سمپلرهاي فيلتردار برداشته شـد و بـر روي گريدهاي مخصوص ميكروسـكوپ الكترونـي 300( mesh holey carbon-coated grids, EMS, (USA ريخته شد.

پس از خشـك شـدن، گريـدها درون ميكروسكوپ الكتروني قـرار داده شـدند و بـا ولتاژ 100 كيلوولت توسط ميكروسكوپ الكترونـي مركــز قلــب تهــران از نــوع CM120 Philips (Netherland )مورد بررسي قرار گرفتند.

بررسي اثرات ضد باكتريايي نانوذرات نقره سـنتز شــده بــا روشهــاي مختلــف: بــراي بررســي اثــر آنتي باكتريال نانوذرات سنتز شـده بـه روش احيـاء
شيميايي، 14 سـويه ي بـاليني بـاكتري شـامل ده ســويهي اشريشــيا كلــي كــه يكــي از آنهــا توليدكننده ي متالوبتالاكتاماز نوع IMP بود (E1 تا E9 و IMP-E ،(يــــك ســــويه ســــودوموناس

مهناز محتشمي و همكاران
مجله علوم پزشكي رازي دوره 19 ،شماره 103 ،دي 1391 آئروژينوزا و سه سويهي اسـتافيلوكوكوس اورئـوس (S1 تا S3 (و نيز تمامي سويههـاي اسـتاندارد كـه سوپرناتانت آنهـا در مراحـل قبلـي جهـت توليـد نانوذرات استفاده شده بود، انتخاب شـدند.
بررسـي خاصيت آنتيباكتريال با تعيين MIC انجام گرفت. براي هر باكتري در دو سري 5 لولهاي سريال رقت از دو ميليليتر نانوذرات نقره (سنتز شده به صورت شـيميايي) در دو ميلـيليتـر محـيط كشـت TSB تهيه گرديد، در يك سري، نانوذرات كوچكتر نقـره و در سري ديگر، نانوذرات درشت تر تلقيح شـدند.

از باكتريهاي تحت آزمايش، كدورت معـادل نـيم مك فارلند تهيه گرديد و بـه تمـامي لولـه هـا، 20 ميكروليتــر از بــاكتري اضــافه شــد و ســپس در انكوباتور 37 درجـهي سـانتي گـراد بـه مـدت 18 ساعت قرار گرفتند. به عنوان كنترل مثبـت، درون يك لوله تنها يك ميلـيليتـر محـيط كشـت TSB ريخته شد و 20 ميكروليتر باكتري تلقيح و انكوبـه گرديد.

به عنوان كنترل منفي و جهت اطمينـان از استريل بودن خود محلـولهـاي نـانونقره ي سـنتزشده، درون يك لوله، يك ميليليتر محـيط كشـت TSB و يك ميلـيليتـر از محلـولهـاي نـانونقرهي سنتز شده اضافه شد و همراه با نمونـه هـاي تسـت انكوبه گرديد.

پس از انكوباسيون، لوله هـاي حـاوي كشت باكتريها، به صورت چشـمي در مقابـل نـورمسـتقيم از نظـر كـدورت ناشـي از رشـد بـاكتري بررسـي شـدند. جهـت اطمينـان از كشـته شـدن باكتري و اثرات باكتريسيدال نانونقره سنتز شده، از لوله هايي كه فاقد كـدورت بودنـد 100 ميكروليتـر برداشته شـد و بـر روي محـيط آگـار خـون دار بـه صورت چمني كشـت داده شـد. بـراي اطمينـان از نتيجه ي آزمايش ها، تمامي تست ها سه بار تكـرار و نتايج با يكديگر مقايسه گرديد.

بحث ونتيجه گيري
پس از ظهور و افـزايش مقاومـت بـاكتريهـا بـه آنتــي بيوتيــكهــا، تحقيقــات بســياري در ســطح آزمايشـــگاهي بـــراي كشـــف مـــواد جـــايگزین آنتي بيوتيكها انجـام شـده اسـت. در سـال 1960 Moyer از نيترات نقره 5 %براي درمان سوختگيها استفاده كرد. او همچنين ثابت كرد كه اين محلول خاصــيت ضــد باكتريــايي عليــه اشريشــيا كلــي، استافيلوكوكوس اورئوس و سودوموناس آئروژينـوزا را دارا مي باشد .

در سال 1968 نيز نيتـرات نقـره بـا سـولفوناميد براي ساخت كرم سولفاديازين كه از طيـف وسـيع فعاليت ضد باكتريايي برخوردار مـيباشـد، تركيـب شد. سولفاديازين نقره عليه باكتريهـاي اشريشـيا كلــي، اســتافيلوكوكوس اورئــوس و ســودوموناس آئروژينوزا موثر بود، اما اين فعاليت زياد قابل توجـه نبــود .

در ســال 2004 Sondi و -Salopek Sondi با بررسي اثرات نانوذرات نقـره بـر بـاكتري اشريشيا كلي به عنوان شاخص بـاكتريهـاي گـرم منفي، آن هـا را بـه عنـوان عوامـل ضـد ميكروبـي جديد معرفي كردند .
(در همان سال Furno و همكـاران پـس از ظهـور بـاكتريهـاي مقـاوم بـه آنتــــي بيوتيــــك و محــــدوديت اســــتفاده از آنتي بيوتيكها، نانونقره را براي درمـان بسـياري از بيماريهاي باكتريايي و قارچي موثر دانست .در ســال 2010 Chaloupka و همكــاران ثابــت كردنــد كــه نــانوذرات نقــره بــه دليــل عملكــرد چندگانــه ي ضــد ميكروبــي، يكــي از مــوثرترين نــانوذرات فلــزي واجــد خاصــيت ضــد ميكروبــي ميباشند .

در اين مطالعه مشخص شد كه نـانوذرات نقـره ي سنتز شده به روش احياء شـيميايي بـه مراتـب بـر روي باكتريهاي گرم منفـي مثـل اشريشـيا كلـي موثرتر بودند، در حالي كه بر روي باكتريهاي گرم
مثبت، به خصوص استافيلوكوكوس اورئـوس تـاثير كمتــري داشــتند.
در مطالعــات مختلــف، نتــايج متفــاوتي حاصــل شــده اســت. در ســال 2010، Nanda و Saravanan نشـان دادنـد كـه نـانوذرات نقره بـر روي اسـتافيلوكوكوس اورئـوس مقـاوم بـه متيسيلين بسيار موثر بـوده اسـت .

در سـال 2011 ،مبارك علي و همكـاران بيـان نمودنـد كـه تاثير نانوذرات نقره بر روي اشريشيا كلي بيشـتر از استافيلوكوكوس اورئوس است و علـت ايـن امـر را ضخامت بيشتر ديواره ي سلولي بـاكتريهـاي گـرم مثبت از جمله استافيلوكوكوس ذكـر كردنـد .

شايد دليل اين تفاوت در نتايج ارائه شـده، مربـوط به تفاوت ساختاري و ژنتيك سويهها بـا توجـه بـه مكان جغرافيايي باشد.

در مطالعه ي اخير مشخص شـد نـانوذرات واجـد اندازه ي كوچك تر، تـاثير آنتـي باكتريـال بيشـتري دارند، به گونـه اي كـه ذرات درشـت تـر بـا غلظـت مشابه ذرات كوچك تر، فاقد اثـرات آنتـي باكتريـال بودند.

(Guzman و همكـــاران در ســـال 2012 تأثير بسيار زياد نانونقره را بر بـاكتريهـاي گرم مثبت و گرم منفي و حتـي برخـي گونـههـاي بسيار مقاوم شده همچون MRSA نشـان دادنـد و بيان كردند كه اندازه ي نانوذرات نقره تأثير زيـادي در خواص ضد باكتري دارد، به گونه اي كه ذراتي با اندازه ي بين 9 تا 19 نانومتر بيشـترين تـاثير را بـر باكتريها داشت

به نظـر مـيرسـد انـدازهي نانوذرات بر مكانيسـم عمـل آنتـي باكتريـال آن هـا تاثير ميگذارد كه اين امر ميتواند احتمالاً به دليل افـزايش سـطح بـه حجـم ذرات نقـره و سـطح در دســترس بــزرگ تــر آن هــا جهــت واكــنش بــا پروتئينهاي باكتريـال يـا بـه دليـل قابليـت نفـوذ بيشتر نانوذرات كوچك تر به درون سـلول بـاكتري باشد.

با توجه به روشهاي متفـاوتي كـه جهـت سـنتز نـانونقره وجـود دارد، روش بيوسـنتز و اسـتفاده از ميكروبها مقرون به صرفه به نظر ميرسد. امـا در اين تحقيق مشخص شد كه سنتز نقره بـا اسـتفاده از سوپرناتانت شش سويهي مختلف باكتري، نتـايج رضايت بخشي نـدارد و از مونوديسپرسـيتي خـوبي برخوردار نيست. علت اين امر ميتواند وجـود مـواد بسـيار متفـاوتي باشـد كـه توسـط بـاكتري توليـد ميشوند و خواص احياء كننـدگي بسـيار متفـاوت دارند.

روش بيوسنتز با استفاده از باكتريها روشي كـم هزينه اسـت، امـا نـانوذرات پلـيديسـپرس ايجـاد ميكند. به نظر ميرسد در صورت ايجـاد تغييـر در روش بيوسنتز نانوذرات، به گونـه اي كـه ذراتـي بـا مونوديسپرسيتي بالاتر و هزينهي كمتر توليد كند، ايــن روش بتوانــد جــايگزين روشهــاي احيــاء شيميايي شود.

نانوذرات نقره با توجـه بـه فعاليـت خوب آنتي باكتريال، ميتواننـد جـايگزين مناسـبي براي آنتي بيوتيكها باشند، اما بايد توجه شـود كـه ميزان مقاومـت سـويه هـاي بـاليني در مقايسـه بـا سويه هاي استاندارد بالاتر ميباشد و بايـد پـيش از تجويز نانوذرات، مقاومت باكتريها نسبت به آنها مورد بررسي قرار گيرد.

با نانونقره دبکوپاک و اثرات فوق العاده این محصول آشنا شوید .